Nel lungo percorso di studio e sviluppo di nuovi farmaci la ricerca parte quasi sempre “in vitro” (in provetta), “in silico” (simulazioni al computer) e su cellule coltivate su plastica; è solo quando ci si rende conto che il farmaco funziona contro un determinato target che si passa alla prova “in vivo” con modelli animali. In massima sintesi, per lo stesso motivo per cui vengono usati i crash test dummies nel testare (un esempio tra molti) gli impianti di sicurezza delle automobili. Così come nessuno di noi vorrebbe mai viaggiare su un’auto potenzialmente (molto) insicura, nessuno sarebbe disponibile a sperimentare personalmente l’efficacia dell'airbag in un impianto industriale di test mentre l’abitacolo sperimentale su cui è seduto viene lanciato contro un muro a velocità sostenuta.
Purtroppo, spesso, nella ricerca scientifica e, nel nostro caso, nello studio di nuovi farmaci, non esistono modelli in vitro, in silico o di altro genere che siano sufficientemente completi e affidabili da predire cosa accadrebbe se quella specifica molecola, quello specifico farmaco, venissero usati su un paziente umano. Come abbiamo detto, dunque, non disponiamo (ancora) di modelli in vitro, in silico o su altro supporto sufficientemente fedeli da predire con precisione gli effetti di un farmaco nell’organismo umano. Perché in vitro è pressoché impossibile disporre di un sistema immunitario completo e dunque predire gli effetti del nuovo farmaco su di esso. Perché mentre in vitro il farmaco arriva direttamente sulle cellule, in un organismo deve invece essere assorbito (nel caso di somministrazioni orali) o comunque distribuirsi nel flusso sanguigno dove ci sono proteine che lo possono legare (quasi sempre) e, possibilmente, deve passare la barriera emato-encefalica.
Perché può accadere che farmaci efficaci in vitro non lo siano altrettanto in vivo, vuoi per la tossicità o perché l’organismo se ne libera troppo velocemente. E vale anche l’esatto opposto: ci sono infatti farmaci poco efficaci in vitro che si rivelano invece molto efficaci in vivo: molti anticorpi monoclonali, ad esempio, funzionano meglio in vivo che in vitro. Infine, per studiare la biologia e i fenotipi conseguenti a manipolazioni genetiche. In campo oncologico, sappiamo moltissimo su cosa fanno certe mutazioni e sulla biologia dei geni implicati nello sviluppo dei tumori proprio grazie a topi transgenici.
In campo oncologico, pressoché tutti i farmaci vengono testati in vivo, anche perché ogni farmaco destinato all’uso in pazienti deve, per legge, essere prima testato in modelli animali. In campo oncologico, spesso, si inizia dai topi, soprattutto per generare modelli di tumore affini a quelli umani. Topi transgenici sviluppano tumori con mutazioni specifiche e possono essere utilizzati sia per studiare i meccanismi di crescita tumorale e sviluppo delle metastasi, sia per testare nuove terapie tanto contro una specifica mutazione/proteina che di immunoterapia. Ci sono poi topi con sistema immunitario compromesso che permettono l’attecchimento di cellule tumorali umane.
Di frequente, poi, non si parla di singolo modello ma di modelli. Sebbene infatti la normativa possa variare in base alla specificità del singolo caso, a livello generale, un nuovo farmaco deve essere testato per tollerabilità/tossicità in almeno due modelli animali prima di poter essere somministrato nel corso di un clinical trial. Di solito si usano ratti (meno frequentemente topi), e poi una seconda specie, spesso cani. Questo permette di scartare farmaci troppo tossici, ma anche di identificare i possibili effetti collaterali che potrebbero insorgere nei pazienti in seguito a dosaggi alti o prolungati di un farmaco.
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La legislazione sulla sperimentazione animale è rigorosa, con rigidi parametri scientifici ed etici volti a evitare l’uso inutile di animali e ogni tipo di sofferenza. Negli studi scientifici, i protocolli per la sperimentazione animale devono essere articolati, dettagliare modalità e finalità dell'impiego di modelli animali, specificare quali e quante misure saranno intraprese per mitigare i possibili effetti della sperimentazione. Durante ogni esperimento, gli animali vengono monitorati quotidianamente da un team, guidati da una figura veterinaria specializzata, che si occupa di controllare numerosi parametri clinici e di garantire trattamenti adeguati in merito ad alimentazione, condizioni igieniche e aspetto sociale degli animali.
Il personale può somministrare trattamenti ai topi tramite sonda gastrica, iniezione IM, IP o IV seguendo regimi di dosaggio specificati dallo sperimentatore. I tumori possono essere misurati su un programma predeterminato basato sul disegno sperimentale. I topi possono essere monitorati per la crescita del tumore e la salute generale. Il personale di base può fornire assistenza tecnica con procedure chirurgiche specializzate, somministrazione di farmaci per studi terapeutici, monitoraggio e misurazione del tumore, formazione del personale, funzionamento dello strumento e analisi dei dati/risoluzione dei problemi.
I test sui topi di laboratorio sono necessari per verificare l’efficacia e la sicurezza dei nuovi farmaci e vaccini. Spesso però non sono sufficienti, perché non si riescono a replicare su soggetti umani i risultati positivi ottenuti sui roditori, secondo meccanismi che sono in gran parte imprevedibili. Ma le cose potrebbero cambiare, soprattutto nella lotta contro i tumori, se il sistema immunitario dei topi fosse "ingegnerizzato" per assomigliare maggiormente a quello umano. Ed è proprio in questa direzione che va il risultato pubblicato sui “Proceedings of the National Academy of Sciences” da un gruppo di ricercatori della University of Southern California (USC).
Ora invece Yuan e colleghi sono riusciti a modificare geneticamente un gruppo di topi in modo che esprimessero molecole CD1d con una struttura molto più simile a quella umana. Nei test in vivo, le CD1d “umanizzate” hanno dimostrato di poter effettivamente attivare una sottopopolazione di linfociti T natural killer in animali a cui era stato somministrato l’alfa-GalCer. “Si tratta del migliore modello mai realizzato in questo campo: siamo riusciti a porre le basi per una rapida identificazione delle immunoterapie in grado di attaccare efficacemente i tumori e per la progettazione di nuovi vaccini", ha sottolineato Weiming Yuan.
La risorsa condivisa sui modelli animali dell'UNM Cancer Center offre supporto alla ricerca sul cancro di base e traslazionale fornendo guida, collaborazione e servizi nei modelli animali e in vivo imaging per la ricerca sul cancro ai membri dell'UNMCCC. I topi immunocompromessi vengono innestati con cellule CD34+ derivate dal sangue cordonale (donatore singolo o donatore multiplo) per "umanizzare" il sistema immunitario del topo. Il sangue periferico viene valutato per le cellule B umane, le cellule T e le cellule mieloidi 12 settimane dopo l'attecchimento per garantire l'umanizzazione.
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L'IVIS Spectrum fornisce sia la bioluminescenza che l'imaging a fluorescenza di topi vivi utilizzando l'illuminazione epi o trans. È possibile acquisire fino a 5 topi contemporaneamente. L'unmixing spettrale consente l'imaging di più sonde fluorescenti nello stesso animale e può sottrarre il segnale di autofluorescenza. Il software per tomografia a bioluminescenza o fluorescenza consente la ricostruzione 3D dei tumori.
L'irradiatore MultiRad 225 è un sistema di irradiazione a raggi X compatto, che rappresenta un'alternativa più sicura agli irradiatori di radioisotopi. Fornisce un'ampia gamma di dosi con un profilo del fascio uniforme. Le applicazioni includono l'irradiazione delle cellule nutritive, la ricerca oncologica, gli studi di sterilizzazione e gli studi di mieloablazione/trapianto di midollo osseo di piccoli animali.
Il VetScan HM5 è un analizzatore ematologico differenziale in cinque parti da utilizzare negli studi sugli animali. È estremamente accurato e fornisce risultati riproducibili paragonabili agli analizzatori di laboratorio di riferimento. Vetscan VS2 è un analizzatore di chimica, elettroliti, immunodosaggi ed emogas per piccoli animali che esegue analisi accurate da sole due gocce di sangue intero, siero o plasma.
Un team del Karolinska Institutet ha messo a punto un protocollo che trasforma cellule staminali pluripotenti umane in isole pancreatiche capaci di produrre insulina. L'hanno provato su otto linee cellulari diverse, fra embrionali e indotte, ottenendo risultati uniformi: una cosa che ai precedenti tentativi non riusciva. Trapiantate in topi col diabete di tipo 1, le cellule hanno regolato la glicemia per mesi.
Il gruppo di Per-Olof Berggren e Fredrik Lanner ha riscritto il processo di coltura aggiungendo un passaggio specifico: lasciare che le cellule formino da sole grappoli tridimensionali, anziché forzarle in un monostrato. Risultato: il protocollo ha funzionato su tutte e otto le linee testate, quattro embrionali e quattro indotte. Le isole prodotte secernono insulina e rispondono al glucosio in laboratorio, con livelli che gli autori definiscono paragonabili a quelli delle isole umane native.
Per la prova in vivo i ricercatori hanno usato un trucco da neuroscienziati: trapiantare le isole nella camera anteriore dell’occhio dei topi, in questo caso topi diabetici. Dopo il trapianto, la glicemia è tornata sotto controllo e ci è rimasta per mesi. Niente cisti, niente proliferazione anomala, niente di quelle derive cellulari che hanno perseguitato i protocolli precedenti. Serve dirlo? Il modello murino è un modello murino. L’occhio non è il pancreas e i numeri di un esperimento controllato non sono i numeri di una sala operatoria.
| Pubblicazione | Wu, Chandel, Bryzgalova et al., “An optimized protocol for efficient derivation of pancreatic islets from multiple human pluripotent stem cell lines”, Stem Cell Reports |
|---|---|
| Dati chiave | Protocollo testato su 8 linee staminali umane (4 embrionali, 4 indotte). Glicemia normalizzata in topi diabetici per oltre sei mesi, senza formazione di cisti o crescita anomala. |
| Elemento critico | Formazione di grappoli tridimensionali come passaggio mancante nei protocolli precedenti. |
Lo studio è uscito su Stem Cell Reports e i ricercatori stanno pronunciando apertamente la frase che di solito si tiene per ultima: lavoreremo verso la traduzione clinica. Il protocollo svedese deve passare dai topi ai trial clinici di fase 1 (sicurezza), poi fase 2 (efficacia preliminare), poi fase 3 (efficacia su larga scala). Anche correndo, parliamo di un decennio. Servono soluzioni industriali per la produzione di isole su scala, una risposta credibile al rigetto autoimmune, e regolatori disposti ad approvare una terapia cellulare che modifica permanentemente il paziente.
Resta aperta la questione del rigetto. Anche con isole derivate da staminali del paziente stesso (le indotte, quelle iPS), il diabete tipo 1 è una malattia autoimmune. Le cellule che il sistema immunitario ha imparato a distruggere una volta, può imparare a distruggerle di nuovo. Da qui in avanti il vero campo di battaglia sarà la protezione delle cellule. Orizzonte stimato: 8-15 anni per una terapia diffusa, e probabilmente non per tutti i diabetici tipo 1.
Ne beneficeranno per primi i diabetici con complicanze gravi, in centri specializzati di Stoccolma, Boston, forse Milano: non chi ha appena ricevuto la diagnosi a quattordici anni in un’ASL di provincia. In quest’ordine, e con la solita differenza tra chi può pagarla privatamente e chi attende la mutua.
Come speriamo di aver chiarito, la sperimentazione in vivo rimane una risorsa inderogabile e un compromesso inevitabile nel progresso scientifico e, nello specifico, per lo sviluppo di nuovi farmaci e terapie. Solo pochi anni fa, ad esempio, il team del professor Scaltriti rilevò in vitro che la combinazione di un inibitore di PI3K con un inibitore di HER2 era incredibilmente efficace, una vera e propria “bomba”. La stessa combinazione, testata poi in vivo, si dimostrò però talmente tossica da essere intollerabile - letale - per tutti i topi utilizzati nella sperimentazione. Sarebbe stato possibile predire un tale livello di tossicità su modelli in vitro o in silico?
D’altro canto, ciò non implica che il dibattito che accompagna da lungo tempo questo tema sia inutile né, tantomeno, che vada posto sotto silenzio. Un dibattito informato, equidistante e oggettivo è, al contrario, uno strumento preferenziale per accogliere istanze di natura scientifica, procedurale, normativa, etica capaci di contribuire al miglioramento del presente così che divenga un futuro progresso.
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